Contribution à l’étude du rôle de la Chromogranine A dans la sécrétion neuroendocrine : Identification de ses partenaires moléculaires impliqués dans la biogenèse des granules de sécrétion”

Résumé
Les cellules neuroendocrines co-expriment plusieurs granines impliquées dans la sécrétion régulée des neurohormones et neuropeptides en induisant la formation des granules de sécrétion (GS). Les partenaires moléculaires impliquant chacune de ces protéines dans le trafic intracellulaire des neurohormones restent à identifier. Dans les cellules non-endocrines COS7 (dépourvues de granines et de voie de sécrétion régulée), notre équipe a montré que l’expression de la chromogranine A (CgA) induit la formation de structures vésiculaires présentant les caractéristiques morphologiques et dynamiques des GS, et capables de libérer leur contenu après stimulation. Le but de ce travail a été d’identifier les mécanismes d’action de la CgA dans l’établissement de la voie de sécrétion régulée. Des expériences de vidéomicroscopie ont révélé que le trafic des organelles néoformés suite à l’expression de la CgA est sensible au Ca2+. De plus, ces organelles montrent des déplacements antérograde/retrograde suggérant leur interaction avec le cytosquelette via le recrutement de moteurs moléculaires. De plus, la dépolymérisation des microtubules ou des filaments d’actine affecte, non seulement la dynamique des GS mais également leur exocytose. Ces données indiquent que les granules formés suite à l’expression de la CgA sont capables d’interagir avec l’actine corticale et la membrane plasmique. En outre, l’analyse du protéome de ces granules purifiés à partir d’une lignée de cellules COS7 exprimant de manière stable la CgA (COS7-CgA) a révélé la présence de protéines liant les éléments du cytosquelette et le calcium. Parmi ces protéines, nous avons focalisé notre attention sur la myosine 1b, du fait de sa capacité à induire le bourgeonnement de compartiments post-golgiens dans les cellules HeLa (Almeida et al., 2011). Dans les cellules COS7-CgA et les cellules neuroendocrines PC12, nous avons montré que l’inhibition de l’expression de la myosine 1b par siRNA provoque une diminution du nombre de granules CgA et l’abolition de sa sécrétion régulée. Nous avons également montré pour la première fois dans les cellules neuroendocrines que l’actine est recrutée à  la membrane du TGN par le biais de la myosine 1b afin d’initier le bourgeonnement des granules contenant la CgA. Dans le but d’identifier le lien moléculaire entre la CgA intragranulaire et les protéines cytosoliques comme la myosine 1b, nous avons étudié les interactions potentielles de la CgA avec les lipides membranaires. A l’aide de membranes de nitrocellulose sur lesquelles sont préadsorbés des lipides constituant les membranes biologiques, nous avons montré que la CgA interagit avec l’acide phosphatidique (PA) et les phosphoinositides (PIP, PIP2, PIP3). Le PA étant décrit comme un acteur majeur de la biogenèse des GS, nous avons étudié ce lipide à l’aide d’inhibiteurs de  synthèse, et nous avons observé une rétention de la CgA dans l’appareil de Golgi associée à une diminution du nombre de granules CgA formés. De plus, une analyse comparée du lipidome des membranes de granules contenant la CgA et de l’appareil de Golgi a révélé un enrichissement des membranes granulaires en PA. L’ensemble de ces données indique que la sécrétion hormonale CgA-dépendante est contrôlée par l’interaction de la CgA avec la membrane du TGN pour former des microdomaines enrichis en PA qui permettront le recrutement de protéines cytosoliques comme la myosine 1b.

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Contribution to the study of the role of Chromogranin A in neuroendocrine secretion: identification of its molecular partners involved in the biogenesis of secretory granules

Summary
Neuroendocrine cells coexpress several granins involved in the regulated secretion of neurohormones and neuropeptides through the promotion of the biogenesis of secretory granules. The molecular signals implicating each of these proteins in the intracellular traffic of neurohormones remain to be elucidated. In the non endocrine COS-7 cells (i.e. devoid of granins and regulated secretory pathway), our team demonstrated that chromogranin A (CgA) expression induces the formation of vesicular organelles with structural characteristics of SG and able to release co-expressed hormones in a Ca2+-dependent manner. The goal of this work was to identify the mechanism of action of CgA in this process. Time-lapse videomicroscopy experiments revealed that the trafficking of CgA-induced organelles is Ca2+-sensitive. Moreover, these organelles exhibit short-range and directed anterograde/retrograde displacements, suggesting their interaction with the cytoskeleton via the recruitment of molecular motors. Furthermore, disruption of microtubules or F-actin-rich cortex affected not only granule trafficking but also their Ca2+-evoked exocytosis, indicating that CgA-induced granules are able to interact with cortical actin and plasma membrane. Moreover, the proteome analysis by LC-MS/MS of CgA containing granules revealed that cytoskeleton- and calcium-binding proteins are specifically recruited to their membrane. Among these proteins, we focused our attention on myosin 1b which has been recently demonstrated to interact with the TGN membrane probably through PIP2 to induce the budding of post-Golgi carriers in HeLa cells (Almeida et al. 2011). In CgA-expressing COS-7 cells (COS7-CgA) and neuroendocrine PC12 cells, silencing of myosin 1b using siRNA provoked (i) the retention of CgA in the Golgi compartment, (ii) the inhibition of CgA-regulated secretion. In non-endocrine HeLa cells, Myo1b motor activity is required for the formation of F-actin foci at the level of the trans golgi network (TGN) membrane. This acto-myosin complex generates a force leading to TGN membrane deformations (Almeida et al., 2011). In our study we demonstrated for the first time that, in neuroendocrine cells, F-actin, more than controlling the integrity of the Golgi complex, is coupled to the TGN membrane through Myo1b, and that actin dynamics is crucial to Myo1b recruitment and to the biogenesis of CgA granules, probably through the membrane deformation. These findings raise the question of the molecular link between CgA and cytosolic proteins, like myosin 1b, required for the biogenesis, the traffic and the exocytosis of secretory granules. We decided to study the potential interaction of CgA with membrane lipids which may represent such a link. Using lipid strips, we showed that CgA specifically binds phosphatidic acid (PA) and phosphoinositides (PIP, PIP2, PIP3). As PA is known to be a crucial actor in secretory granule biogenesis, we first studied the function of this lipid. Using inhibitors of diacylglycerol (DAG) kinase, and phospholipase D, to block PA synthesis, we observed the retention of CgA in the Golgi apparatus associated to a lack of CgA granules, demonstrating that PA mediates the granulogenic role of CgA. Interestingly, lipidomic analysis of purified CgA-containing granules and Golgi membranes from COS7-CgA cells revealed an enrichment of PA in granular membrane. Altogether, our results indicate that CgA-dependent hormone secretion could be mediated by CgA interaction with TGN membrane to form PA-enriched microdomains allowing the recruitment of cytosolic proteins, such as myosin 1b which regulates the budding of CgA-containing secretory granules.

Présentée le 6 février 2014

Laboratoire où a été préparée la thèse :

– Laboratoire DC2N – Inserm U982 – Mont-Saint-Aignan

Nom du directeur de thèse : Pr Maité Montéro-Hadjadje