Contribution à l’étude fonctionnelle des effets du PACAP sur l’ontogenèse du cervelet chez la souris in vivo.
Les effets neurotrophiques du pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) au cours du développement du cervelet sont maintenant bien établis. En effet, il a été montré que l’application de PACAP sur des cellules en grain en culture stimule l’élongation des neurites, favorise la survie des neurones et exerce une action anti-apoptotique en inhibant l’activité de l’enzyme effectrice, à savoir la caspase-3. Par ailleurs, le PACAP et son récepteur PAC1 sont présents dans le cervelet dès la période embryonnaire, suggérant que le PACAP pourrait jouer un rôle crucial au cours de l’ontogenèse du cortex cérébelleux. L’ensemble de ces observations nous a tout d’abord amenés à entreprendre l’étude du développement du cervelet chez les souris dont le gène PACAP a été invalidé (PACAP-/-), à 4 et 7 jours postnataux (P4 et P7), deux étapes clés de la neurogenèse des cellules en grain. L’analyse morphométrique des couches cérébelleuses a mis en évidence une réduction significative de l’épaisseur des couches granulaires externe (CGE) à P4 et interne (CGI) à P7 chez les souris PACAP-/-, résultant d’une réduction du nombre de cellules. Par ailleurs, les études par immunohistochimie, western blot et PCR quantitative nous ont permis de démontrer que l’expression de la synaptophysine, un marqueur de neurones matures, est diminuée à P4 et P7 chez les souris PACAP-/-. Enfin, l’étude d’un marqueur apoptotique, la caspase-3 clivée, a montré que le nombre de cellules exprimant la caspase-3 ainsi que l’activité biologique de l’enzyme sont significativement augmentés chez les souris PACAP-/-. Ces données suggèrent que l’absence de PACAP chez les souris PACAP-/- engendre un déséquilibre en faveur de l’apoptose entraînant une augmentation de la mort cellulaire des neurones en grain matures de la CGI.
Le FasL est un facteur de mort cellulaire impliqué dans l’apoptose de plusieurs types cellulaires au cours du développement et son mécanisme d’action fait intervenir comme pour le PACAP, la voie mitochondriale, amenant à l’activation de la caspase-3. Nous avons donc choisi de caractériser les effets du FasL sur le développement du cervelet chez des souris sauvages et PACAP-/- afin de déterminer si le PACAP est en mesure de bloquer la mort cellulaire induite par FasL. Pour ce faire, nous avons réalisé des injections sous-durales de FasL seul ou associé avec le PACAP au niveau du cervelet de souris sauvages et PACAP-/-. Bien que le récepteur Fas soit localisé à la fois sur les cellules en grain et les cellules de Purkinje, le FasL diminue spécifiquement l’épaisseur de la CGI et augmente le nombre de cellules en grain matures exprimant la caspase-3 clivée chez les souris. Cet effet du FasL est partiellement bloqué en présence de PACAP chez les souris sauvages et totalement inhibé chez les animaux PACAP-/-. Enfin, les tests comportementaux réalisés sur des souris sauvages traitées par le FasL et le PACAP n’ont pas révélé de déficit moteur significatif chez ces animaux excepté un défaut d’équilibre transitoire à P8 chez les animaux traités simultanément par le FasL et le PACAP.
L’ensemble de ce travail indique que le PACAP possède un rôle neurotrophique et anti-apoptotique in vivo sur les cellules en grain matures. De plus, le PACAP est capable de s’opposer aux effets pro-apoptotiques de FasL, indiquant l’existence d’un équilibre physiologique entre les facteurs neurotrophiques et les facteurs de mort cellulaire au cours du développement du cervelet.
Mots Clés: cortex cérébelleux, PACAP, FasL, souris PACAP-/-, apoptose, in vivo.
Présentée le 14 mai 2008
Laboratoire où a été préparée la thèse : Unité INSERM 413, Laboratoire de Neuroendocrinologie Cellulaire et Moléculaire, 5 place Emile Blondel, 76821 Mont Saint Aignan Cedex
Nom du directeur de thèse: Dr Delphine BUREL et Dr Hubert VAUDRY (Co-directeur)
