Etude fonctionnelle des gènes régulés au cours de la différenciation des cellules PC12 induite par le NGF et le PACAP
Les cellules PC12 constituent un modèle très largement utilisé pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la différenciation neuronale. En particulier, il a été montré que dans ces cellules, la neurotrophine nerve growth factor (NGF) et le neuropeptide pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) exercent de puissants effets pro-différenciateurs qui se manifestent entre autre par l’apparition de prolongements cytoplasmiques, une augmentation du volume cellulaire et un arrêt de la prolifération.
Ces effets du NGF et du PACAP sur la différenciation des cellules PC12 sont mimés par des stimulateurs de l’adénylyl cyclase, comme la forskoline, et des analogues de l’AMPc, comme le dbcAMP. L’utilisation d’inhibiteurs spécifiques de différentes voies de transduction révèle que la neuritogenèse est indépendante de l’activation de la protéine kinase A (PKA) mais requiert la phosphorylation de l’extracellular signal-regulated kinase (ERK). En partant de ces observations, le but de notre étude a été d’identifier de nouveaux mécanismes moléculaires impliqués dans la différenciation des cellules PC12. Les gènes activés par le NGF, le PACAP et l’AMPc ont été identifiés par microarrays. Nous avons ensuite sélectionné les gènes induits par les deux facteurs neurotrophiques et l’AMPc puis, à l’aide d’inhibiteurs spécifiques, nous avons recherché par PCR en temps réel ceux dont la stimulation ne nécessite pas l’action de la PKA mais requiert la phosphorylation de ERK. Cette approche, combinée à une analyse bibliographique, nous a conduits à sélectionner quelques gènes dont la villine 2, l’immediate early response 3 (Ier3), l’early growth response 1 (Egr1) et la serine proteinase inhibitor, clade B, member (serpine b1a). Nous avons ensuite recherché la fonction de ces gènes en utilisant la technique des ARN d’interférence (siRNA). Les résultats indiquent que la villine 2 est impliquée dans l’augmentation du volume cellulaire alors que Egr1 contrôle la neuritogenèse sans modifier la prolifération des cellules. En revanche, Ier3 et la serpine b1a n’affectent aucun des effets observés au cours de la différenciation des cellules PC12. Le NGF et le PACAP étant aussi capables de favoriser la survie de ces cellules lorsqu’elles sont cultivées en conditions induisant leur apoptose, nous avons dans un second temps recherché l’implication de la serpine b1a dans ce processus. Les résultats montrent que l’expression de la serpine b1a induit une diminution significative de l’activité de la caspase-3, une protéase clé de la cascade apoptotique. Cet effet de la serpine b1a sur l’activité de la caspase-3 s’accompagne d’une augmentation de la survie des cellules PC12 cultivées en l’absence de sérum mettant ainsi en évidence l’implication de ce gène dans l’effet neuroprotecteur du PACAP et du NGF.
En conclusion, ces travaux ont permis de caractériser certaines voies de transduction et quelques gènes impliqués dans les effets du NGF et/ou du PACAP sur la différenciation et la survie des cellules PC12. Ces données ouvrent de nouveaux axes de recherche pour l’étude de la différenciation neuronale qui pourraient à terme permettre le développement de stratégies thérapeutiques pour le traitement d’accidents vasculaires cérébraux ou de maladies neurodégénératives, telles que l’Alzheimer ou le Parkinson.
Mots Clés: NGF, PACAP, cellules PC12, différenciation, neuritogenèse, AMPc, Egr1, Villine 2, Serpine b1a, Ier3
Présentée le 5 octobre 2007
Laboratoire où a été préparée la thèse :
Unité INSERM 413, Laboratoire de Neuroendocrinologie Cellulaire et Moléculaire, 5 place Emile Blondel, 76821 Mont Saint Aignan Cedex
Nom du directeur de thèse: Dr David VAUDRY
